本发明公开了一种产a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法,属于遗传工程领域。本发明采用分子手段,将来源于小鼠中编码ATP-柠檬酸裂解酶ACL基因过量表达于发酵法生产a-酮戊二酸的菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06中,获得了一株ATP-柠檬酸裂解酶活性提高的酵母工程菌Y.lipolyticaACL。与出发菌株相比:本发明提供的基因工程菌能以甘油为唯一碳源,在胞内积累0.89mM/gDCW的乙酰辅酶A,ACL活性提高了7.5倍(3.56U/mgprotein);a-酮戊二酸产量达到45.3g/L,是出发菌株的1.29倍;丙酮酸产量降低到17.2g/L,是出发菌株的68.8%,具有广阔的应用前景。